Prácticas: Immunocitoquímica y Citotoxicidad

Cuelgo aquí el pequeño informe que hicimos cuatro compañeros tras acabar las prácticas de Biología Celular. Nada del otro mundo, más que nada para enseñar qué tipo de prácticas hacemos en la carrera de biología en la Universitat de Barcelona. Para quien le interese.

INMUNOCITOQUÍMICA

Practicas_biocel1La citocalasina desestructura el citoesqueleto de actina. En las células marcadas con faloidina y tratadas con este fármaco, observamos cambios importantes en la morfología celular. No se aprecian fibras de estrés, pero sí obtenemos señal. Ésta consiste en una estructura desorganizada distribuida de forma desigual, con zonas de mayor densidad. En base a la literatura, sabemos que este cambio estructural se debe a que la citocalasina se une al extremo (+) de las fibras de actina, inhibiendo su polimerización y resultando en la despolimerización del filamento por el extremo (-). El cambio de forma es debido a que los filamentos de actina son los principales responsables de la morfología celular.

La citocalasina no afecta a la dinámica de polimerización del citoesqueleto de tubulina. Encontramos microtúbulos en las células tratadas con el fármaco. Sin embargo, éstos se distribuyen de manera distinta a nuestra muestra control. Éste hecho se debe a que la célula ha cambiado su morfología por la acción de la citocalasina sobre las fibras de actina.

En base a nuestros experimentos no podemos concluir cuál es el efecto de la citocalasina sobre los filamentos intermedios. Sin embargo, la literatura afirma que este fármaco no afecta a este elemento del citoesqueleto.

La colchicina no afecta a la estructura de los microfilamentos de actina, ni tampoco a la morfología celular. Al igual que en nuestro control, apreciamos fibras de estrés en las células tratadas con éste fármaco.

La colchicina inhibe la polimerización de los microtúbulos mediante su unión a los dímeros de tubulina. Apreciamos una señal difusa en el citoplasma de las células en lugar de microtúbulos organizados como en el control.

Además, en todas las células tratadas con colchicina observamos un mayor número de células en mitosis (forma esférica). Esto se debe a que las células se detienen durante este proceso ya que no puede formarse el huso mitótico al interrumpirse la dinámica microtubular.
En este caso tampoco podemos inferir cuál sería el efecto de este fármaco sobre los filamentos intermedios. Pero, en base a la literatura podemos afirmar que no observaríamos ningún efecto.

Para determinar el efecto del taxol sobre los filamentos intermedios, podríamos, por ejemplo, realizar una inmunocitoquímica* sobre un cultivo primario de células epiteliales tratadas con taxol. El anticuerpo primario debería ir dirigido contra las queratinas, principal constituyente de los filamentos intermedios en las células epiteliales. El anticuerpo primario estaría realizado en ratón, mientras que el secundario (conjugado con TRITC) estaría realizado en conejo e iría dirigido contra anticuerpos de ratón.

Realizaríamos dos controles: uno en el que las células no hubiesen sido tratadas con el fármaco; y otro en el que añadiríamos únicamente anticuerpo secundario para cerciorarnos de la especificidad de unión de éste con el primario.

* Para ello, seguiremos el protocolo estándar que incluye fijación, permeabilización, bloqueo, incubación con anticuerpo primario, incubación con anticuerpo secundario, tinción nuclear y montaje.



CITOTOXICIDAD

Practicas_biocel2El patrón de viabilidad observado en todos los controles corresponde al esperado (control y NaCl alta viabilidad; SDS baja viabilidad). La estaurosporina afecta poco a la viabilidad (sólo la reduce en un 16%). Como todos nuestros controles han dado los resultados esperados, teniendo en cuenta sólo este experimento, no podemos concluir que la estaurosporina sea citotóxica.

No obstante, sabemos por la literatura que la estaurosporina es citotóxica. Este experimento se muestra, por lo tanto, incapaz de reflejar dicha citotoxicidad. Esto puede deberse a que la exposición al fármaco no ha sido lo suficientemente grande como para apreciar diferencias en la actividad mitocondrial. Una observación previa de la muestra por microscopía de contraste de fases nos reveló que la morfología celular se vio seriamente afectada (forma esférica). Lo cual podría ser indicativo de citotoxicidad. Sin embargo, para hacer tal afirmación deberían realizarse técnicas complementarias.

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